转基因动物的基因转移方法及应用

遗传的基本物质是DNA，基因则是位于染色体上有遗传效应的DNA片段，下面我们一起来看看转基因动物的基因转移方法和应用。

转基因动物的基因转移方法及应用

哺乳动物的基因转移方法是通过显微注射将重建的目的基因(或基因组片段)注入实验动物的受精卵(或植入前的胚胎细胞)，然后将受精卵(或植入前的胚胎细胞)植入受体动物的输卵管(或子宫)，使其发育成携带外源基因的转基因动物。

根据导入外源基因的方法和对象的不同，目前生产转基因动物的方法主要有显微注射、逆转录病毒、胚胎干细胞、电脉冲、精子载体导入等

显微注射法

是最常用的方法，成功率高。以转基因小鼠的生产为例，一般流程如下。

1、收集受精卵

(1)超数排卵:6-8周龄的雌性小鼠腹腔注射5U妊娠马血清促性腺激素(PMSG)和2.5~5.0U促排卵激素(HCG)，然后与12周龄-1岁的雄性小鼠以1∶1的比例交配，交配成功的标志是在雌性小鼠的阴道开口处发现白色阴道栓。

(2)取受精卵:雄鼠关笼后第二天早上，用宫颈脱臼法杀死带阴道栓的雌鼠，取出输卵管，放入培养基中，在体视显微镜下仔细切开输卵管扩大的壶腹，用透明质酸酶溶液稍洗，将受精卵从输卵管中分离出来，流入培养基中，在体视显微镜下选择原核清晰的受精卵，转移到装有培养基的胚胎培养皿中。然后，向培养皿中滴入矿物油以覆盖培养液的表面，将培养液在CO2培养箱(37℃，5% CO2，95%空气)中孵育约5小时(一般在上午10: 00左右取受精卵，培养至l3时可见雌、雄原核，13:00 ~ 18:00之间形成大部分受精卵并清晰可见)。

其次，将DNA溶液注入受精卵的雄性原核

在受精卵中，有两个原核，分别来自卵子和精子。通常来自精子的雄性原核较大，可以容纳更多的外源DNA，所以通常将DNA溶液注入雄性原核。此外，要导入的基因DNA的纯度必须通过琼脂糖凝胶电泳来确定。将含有10 ~ 20个受精卵的培养液滴和DNA液滴一起放在载玻片上，然后固定在显微注射仪的载物台上，将视野中心调整到DNA液滴上，用右手装有矿物油的玻璃移液管吸DNA液，吸量根据DNA液和矿物油之间的弯月面位置，然后将视野中心移动到

在受精卵滴上，左手控制持卵吸管，用负压固定受精卵，右手吸管尖端向固定好的受精卵移动，然后插入受精卵雄性原核，将DNA溶液注入人类雄性原核。要确认是否注射过，需要用肉眼确定雄性原核是否肿胀。只收集未受损的卵，在37℃CO2培养箱中培养过夜。第二天，选择发育成2个细胞的卵。

(3)将2个细胞的受精卵移植到假孕雌性小鼠的输卵管中

输精管结扎术的雄性小鼠与发情的雌性小鼠交配(一般选用ICR小鼠)可以刺激宫颈管，激活雌性小鼠体内的黄体，为继续妊娠创造内分泌环境。这种老鼠叫伪孕母鼠。显微注射的2细胞受精卵在交配第三天移植到假孕雌鼠输卵管内仍能正常发育。手术过程中，最好在双侧输卵管移植l2卵，这样可以获得8只完好的幼仔，有时只能产一只幼仔，因为DNA注射造成的损伤会使很多受精卵中途停止发育。

四.导入基因的鉴定

通常胚胎移植出生的后代中，约有20% ~ 30%引入了基因。因此，应采用SouthernBlot或PCR对导入的基因进行分析，以筛选成功导入外源基因的小鼠进行育种和繁殖。

基因显微注射法的特点是导入整合外源基因效率高，无需载体即可直接转移目的基因，目的基因长度可达LOOK B (10万个碱基对)。可以直接获得纯系，所以实验周期短。但需要昂贵精密的仪器，技术操作难度大，外源基因的整合位点和拷贝数无法控制，容易导致宿主动物基因组插入突变，造成相应的性状改变甚至死亡。

五、逆转录病毒感染法

逆转录病毒具有侵入宿主细胞并整合入细胞染色体DNA的能力。外源基因DNA插入逆转录病毒载体，由辅助细胞包装成高感染度的病毒颗粒。感染胚胎后，将感染的桑树胚胎细胞导入子宫，可发育成携带外源基因的子代动物。

该方法整合率高，靶基因不易破坏，且多为单拷贝、单点整合，适用于原核难以观察的家禽受精卵。由于病毒衣壳大小的限制，目的基因不能超过10kb，否则会影响活性和稳定性。此外，病毒DNA可能会影响宿主动物体内外源基因的表达。

胚胎干细胞法

胚胎干细胞(胚胎干细胞)是指从胚泡期内细胞团中分离出来的未分化胚胎细胞，具有发育全能性，可体外培养

(1)获得发育到一定时期的胚胎，培养后剥离分散内细胞团，再培养，最后分离扩散鉴定胚胎干细胞。

(2)通过基因打靶技术，利用逆转录病毒感染和电脉冲方法将外源基因导入es细胞，体外培养筛选具有外源基因表达的细胞。

(3)获得胚泡期胚胎作为胚胎干细胞移植受体。

(4)通过显微操作将胚胎干细胞注入胚泡期胚胎的腔内，使其接近内细胞团，成为嵌合体。

(5)培养注射胚胎后，筛选无发育缺陷的胚泡，在交配第三天移植到假孕受体动物的子宫中，培养转基因动物。这种方法外源基因整合率高，在植入囊胚前筛选合适的转化es细胞克服了以前只能选择后代的缺点，可以充分利用分子生物学发展的各种先进方法，是一种很有前途的技术。缺点是很难建立ES细胞系。而且因为嵌合体途径，实验周期长。

电脉冲法

电穿孔又称电穿孔，是将供体DNA与受体细胞充分混合，在外界高电压、短脉冲下改变细胞膜结构，使细胞膜发生瞬间可逆的电穿孔，使一定大小的DNA通过细胞膜进入细胞，被转运到细胞核。1980年，齐默曼等人首次通过电脉冲技术将药物和染料引入小鼠胸腺细胞和红细胞。同年，王天凯和诺依伊尔首次报道用电脉冲法将TK基因导入CTK小鼠的CTK细胞，从106个处理细胞中获得67个转化克隆，开创了外源基因电脉冲法的先河。目前，电脉冲法主要用于动物胚胎干细胞的转化。

精子导入法

精子载体导入是构建转基因动物的一种新尝试，以精子为外源基因载体，通过受精将外源基因导入受精卵，整合到受精卵的基因组中。这种方法简单方便，依靠生理收带过程，避免了对原核的损伤。但实践中成功率低，精子能否作为外源DNA的载体存在争议。

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